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Nature Microbiology volume 8、pages 860–874 (2023)この記事を引用

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1825年オルトメトリック

メトリクスの詳細

ワクチンは、新型コロナウイルス感染症のパンデミックと戦う上で重要な役割を果たします。将来のパンデミックの制御には、新たに出現した SARS-CoV-2 変異種に対する高い有効性とウイルス感染を減らす能力を備えた改良されたワクチンが必要です。今回我々は、シリアンハムスターにおけるmRNAワクチンBNT162b2、アデノウイルスベクター化スパイクワクチンAd2-spike、弱毒化生ウイルスワクチン候補sCPD9の免疫応答と前臨床有効性を、同種ワクチン接種レジメンと異種ワクチン接種レジメンの両方を使用して比較した。ワクチンの有効性の比較は、ウイルス滴定から単一細胞 RNA 配列決定までの読み取り値を使用して評価されました。我々の結果は、sCPD9ワクチン接種が、迅速なウイルス除去、組織損傷の軽減、前形質芽細胞の迅速な分化、強力な全身および粘膜の体液性反応、異種SARS攻撃後の肺組織からのメモリーT細胞の迅速な回収など、最も強力な免疫を誘発したことを示しています。 -CoV-2。全体として、私たちの結果は、弱毒化生ワクチンが現在利用可能な新型コロナウイルス感染症ワクチンよりも利点があることを示しています。

2023 年の時点で、13 の新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) ワクチンが WHO による緊急使用リスト (EUL) の基準を満たしています1。認可されたワクチンには、不活化ウイルスおよびサブユニットワクチン、アデノウイルスベクター化スパイクワクチンおよびヌクレオシド修飾 mRNA ワクチンが含まれます2。利用可能なワクチンは重篤な病気から長期にわたって保護しますが、特にオーミクロン変異体の出現と蔓延後は、免疫力の低下は明らかです 3,4。

最適な COVID-19 ワクチンは、重篤な疾患から保護し、広範囲のウイルス変異体に対応し、SARS-CoV-2 の感染を防止または制限します。弱毒化生ワクチン (LAV) は、麻疹、おたふく風邪、風疹 (MMR) などのウイルス感染症に対して効果的に使用されており、他の種類のワクチンに比べて利点があります。それらはアジュバントを必要とせず6、インフルエンザLAVの場合のように局所投与、例えば鼻腔内投与が可能である7。鼻腔内 LAV は複製能力のあるウイルスで構成され、感染と抗原産生の自然な過程を模倣しているため、局所投与される複製能力のないベクターまたは抗原ベースのワクチンとは異なります8。過去に使用されていた経験的に生成されたワクチンとは対照的に、最新の LAV 設計は分子ツールを利用して、免疫原性と抗原の完全性を維持しながらウイルスの複製と毒性を制限します9。 LAV の合理的設計で採用されている最近の戦略の 1 つはコドンペアの非最適化 (CPD) であり、これは DNA10 と SARS-CoV-212 を含む RNA ウイルス 11 の両方に適しています。

現在の COVID-19 ワクチンは筋肉内に投与され、高力価の中和抗体、中枢およびエフェクターメモリー T 細胞 13、鼻腔内に存在する CD8+ T 細胞 14、胚中心 B 細胞 15、長命形質細胞 16 などの全身免疫を効率的に誘導します。ただし、この経路は、持続的な粘膜 IgA および IgG 応答 17,18 および肺組織に存在する記憶細胞応答 19 を誘導する効果は低くなります。ウイルス侵入部位の粘膜抗体は、感染力と伝播を制限する上で重要な役割を果たします20。したがって、組織に存在する記憶細胞は、局所的な位置決めによりより高速な想起応答を受け、より早期の同族抗原認識を可能にします 21。したがって、呼吸経路を介して投与されるワクチンは、標的病原体に対して強力な局所粘膜免疫を提供すると期待されています22。ここでは、さまざまなワクチンとワクチンレジメンを比較し、各ワクチンによって付与される全身免疫および粘膜免疫を評価します。

異種 SARS-CoV-2 デルタ攻撃の設定において、市販の mRNA ワクチン BNT162b2 と 2 つのワクチン候補、SARS-CoV-223 のスパイク糖タンパク質を運ぶアデノウイルスベクターである Ad2-Spike と生ワクチンの有効性と作用機序を評価しました。 -sCPD924、25と名付けられた弱毒化SARS-CoV-2。有効性を評価するために、シリアンハムスターに単回ワクチン接種（プライムオンリーレジメン）を行い、ワクチン接種から21日後にSARS-CoV-2 デルタ変異体を接種した。ハムスターの別のグループは、21日間隔で2回のワクチン投与を受け(プライム-追加免疫レジメン)、追加免疫の14日後に攻撃感染させた(図1a)。ワクチン接種後の安定した体重増加によって証明されるように、すべてのワクチン接種は忍容性が良好でした（拡張データ図1a）。

a、実験計画。シリアンハムスターは指示に従ってワクチン接種され、SARS-CoV-2（1×105 pfu SARS-CoV-2 デルタ）で攻撃されました。プライム実験とプライムブースト実験は独立して実行されました。 b、ウイルス攻撃後の体重(%)を分析時点まで測定し、ワクチン接種グループに従って表示した。四分位数と中央値を含むヴァイオリンプロット (切り捨て)。 c〜l、プライムワクチン接種およびチャレンジ動物の結果（c〜e、i、j）およびプライムブーストワクチン接種およびチャレンジ動物の結果（f〜h、k、l）：ゲノムRNA（gRNA）コピー数口腔咽頭スワブ (c、f) および均質化された肺組織 (d、g) で検出されました。 e、h、50 mgの均質化肺組織あたりのpfuとしての複製能のあるウイルスの定量。点線は検出限界 (DL = 5 pfu) を示します。 DL/2 = 2.5 pfu i,kに設定された検出限界未満の力価。肺炎、肺胞上皮壊死および内皮炎の重症度を含む肺炎症をスコア化した。 j、l、血管周囲浮腫および肺胞浮腫を説明する肺浮腫スコア。 m、H&E 染色した左肺切片は、5 dpc での異なるワクチンスケジュールと非ワクチン接種動物の間の気管支周囲のカフおよび統合領域を含む肺炎の異なる重症度を示しています。スケールバー、3 mm。 c–e および f–h の散布ドットプロットでは、線は平均を示し、記号は個々のハムスターを表します。 i,j,k,l では、中心線は中央値を表し、ボックスは 25 から 75 パーセンタイルを表し、ひげは最小値から最大値を表します。記号は個々のハムスターを表します。 c〜lでは、二元配置分散分析（ANOVA）とTukeyの多重比較検定が示されています。 n = 1 グループあたり 5 匹の動物。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。図 1a は BioRender.com で作成されました。

ソースデータ

すべてのワクチン接種戦略は、SARS-CoV-2感染による体重減少からハムスターを保護しました（図1b）。気道内のウイルスRNAの存在によって証明されるように、1回のワクチン接種後は、どのワクチンもSARS-CoV-2 デルタによる感染を完全に防ぐことはできませんでした（図1c、d）。 sCPD9ワクチンのみが、感染後2日目（dpc）に複製ウイルスを検出不可能なレベルまで効果的に減少させた（図1e）。プライムブーストワクチン接種により、SARS-CoV-2に対する全体的なワクチンの有効性が向上しました（図1f、g）。プライムブーストワクチン接種後、ウイルス RNA は大幅に減少しましたが、依然としてすべてのグループの口腔咽頭スワブおよび肺で検出可能でした。 sCPD9を使用したワクチン接種スキームは、ウイルスRNAの減少に優れていました（図1f、g）。同様に、肺内の複製能を有するウイルスのレベルは、ワクチン接種動物では2dpcで有意に減少した。重要なことに、異種（mRNA）または同種（sCPD9）プライミングに関係なく、sCPD9ブースターワクチン接種のみが複製ウイルスレベルを検出閾値未満に減少させました（図1h）。結果は、肺からのバルク RNA の配列決定によって確認されました (拡張データ図 1b)。

感染誘発性の肺損傷を判定するために、攻撃を受けたハムスターを組織病理学によって検査した。単回ワクチン接種後、sCPD9は、肺領域の硬化が少なく（図1m）、肺の炎症、気管支炎、浮腫のスコアが低いことで証明されているように、炎症と肺炎の予防に最も効果的でした（図1i、jおよび拡張データ図1c〜f）。）。注目すべきことに、他のワクチン接種スケジュールを受けた動物は、より顕著な気管支過形成を示した(拡張データ図2)。同様の傾向がプライムブーストレジメンでも観察されました。ただし、特に mRNA ワクチンは、相同追加免疫の結果として組織学的転帰の改善を示しました（図 1k、l および拡張データ図 1g-j）。全体として、相同な sCPD9 プライム-ブーストワクチン接種は、炎症から優れた肺保護を提供しました (図 1m および 2a、および拡張データ図 2)。肺トランスクリプトーム分析では、ワクチン接種されたハムスターにおける感染および炎症関連遺伝子の広範なダウンレギュレーションも示され、同種および異種のsCDP9ワクチン接種で最大の効果が見られました（補足図1）。

a、プライムブーストワクチン接種実験からの 5 dpc の H&E 染色肺切片では、血管周囲リンパ球 (1)、血管周囲浮腫 (2)、化生上皮リモデリング (3)、内皮炎 (4) および肺胞浮腫 (5) が同定されました。番号付きの矢印、示されているグループ。スケールバー、90 μm。 b、肺細胞の均一多様体近似投影法（UMAP）を使用した単一細胞トランスクリプトームの二次元投影図（プライムブースト実験）。細胞は、既知のマーカー遺伝子に基づいて注釈が付けられた細胞タイプごとに色付けされます。 c、d、肺葉ごとの単離された肺細胞（ct細胞）の手動細胞数、プライムブースト実験のscRNA配列決定細胞頻度に基づいて計算された示された細胞タイプ（PMN、単球性マクロファージ）の数（c）および主要な実験 (d)。平均±標準誤差の棒プロット、記号は個々のハムスターを表す (nsCPD9 = 4、nmRNA = 4、nAd2 = 4、nmock = 4、nsCPD9+sCPD9 = 3、nmRNA+sCPD9 = 3、nmRNA+mRNA = 3、nAd2+Ad2 = 3、nmock+mock = 4)、通常の一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定、**P < 0.01。 e、モック-モックワクチン接種動物と比較した、4つのプライム-ブーストワクチン接種戦略の示された細胞型における遺伝子発現の変化倍数を示すドットプロット。選択されたインターフェロン刺激遺伝子と炎症促進性サイトカインは次のように視覚化されます。色とポイントサイズは、それぞれ、モックモックワクチン接種動物と比較したワクチン接種動物の log2 変換倍率変化 (FC) と P 値を示します。調整された P 値 (Padj) は、両側 Wald 検定 P 値の Benjamini-Hochberg 補正を使用して DEseq2 によって計算されました。遺伝子は教師なしクラスタリングによって順序付けされます。 f、2dpcにおける気管支の長手方向切片におけるin situハイブリダイゼーションによるウイルスRNAの局在。赤色シグナル、ウイルス RNA。青、ヘマラム対比染色。スケールバー、30 μm。

ソースデータ

炎症のレベルと細胞反応を相関させるために、肺サンプルの単一細胞RNA配列決定（scRNA-seq）を実行しました（図2bおよび補足図2a）。結果は、単球性マクロファージの肺動員が、sCPD9 + sCPD9ワクチン接種動物において2 dpcで有意に減少したことを示した(図2cおよび補足図2b)。それほど顕著ではないものの、同様の効果が、sCPD9プライムのみのワクチン接種を受けた動物でも観察されました（図2dおよび補足図2c）。さらに、SARS-CoV-2感染によって誘導されるインターフェロン刺激遺伝子26は、ワクチン接種されていない動物と比較してワクチン接種された動物では広く下方制御されており、単球マクロファージ、Treml4+単球および内皮細胞が特に反応しているようです（補足図3）。 Cxcl10 や Tnfsf10 などの炎症メディエーターは、インターフェロン刺激遺伝子と比較して、細胞型全体でより均一な応答パターンを示しました（図 2e および補足図 4a）。マクロファージのサブタイプはワクチン接種グループ間で異なる遺伝子発現パターンを示したので、in situハイブリダイゼーションによって肺内のウイルスRNAの分布を調べました（図2fおよび補足図4b）。ワクチン接種を受けていない動物では、ウイルス RNA が肺全体で検出されましたが、mRNA+mRNA ワクチン接種ではその発生が単一パッチに減少しました。 sCPD9 + sCPD9 動物では、ウイルス RNA はほとんど検出できませんでした（補足図 4b）。注目すべきことに、mRNA+mRNA動物では、検出可能なウイルスRNAのほとんどがマクロファージに存在していました（図2f）。

体液性反応を決定するために、攻撃前（0 dpc）、プライム（図3a〜d）およびプライムブースト（図3e〜h）ワクチン接種ハムスターの2および5 dpcで収集したハムスター血清のSARSを中和する能力を定量しました。 -CoV-2の変異体。 sCPD9ワクチン接種者からの血清が祖先SARS-CoV-2変異体B.1を中和する能力は、他のすべてのグループの能力を大幅に上回りました（図3a）。同様に、sCPD9 血清は、懸念される変異体 B.1.351 (ベータ)、B.1.617.2 (デルタ)、および B.1.1.529 (Omicron、BA.1) の優れた中和を提供しました (図 3b、c)。 Omicron BA.1 の場合、中和能力はすべてのグループで大幅に減少しました。しかしながら、sCPD9血清による中和は有意であった(図3d)。一般に、攻撃感染により、すべてのグループで時間の経過とともに中和抗体が 5 dpc 増加しました（図 3a-d）。

a〜h、SARS-CoV-2の初回ワクチン接種（a〜d）およびプライムブーストワクチン接種（e〜h）の前（0 dpc）および2または5 dpcで受けたハムスターの血清中和力価。中和能力は、バリアント B1 (a、e)、ベータ (b、f)、デルタ (c、g)、およびオミクロン BA.1 (d、h) に対してテストされました。検出の下限は希釈 1:8 (点線)、上限は 1:2,048 でした。棒グラフは平均±標準誤差、条件ごとに n = 5。 e – h では、ベースライン (0 dpc) で n = 10。ただし、e と g では nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 9、h では nsCPD9+sCPD9 (0dpc) = 6、nmRNA+sCPD9 (0dpc) = 9 を除きます。、血清量が限られているため、nmRNA+mRNA (0dpc) = 8、nAd2+Ad2(0dpc) = 8、および nmock+mock (0dpc) = 7。ｉ、刺激後０日目および２日目のプライム・ブーストワクチン接種ハムスターからの血清中のスパイク、ＯＲＦ３ａおよびヌクレオカプシドタンパク質に対するＳＡＲＳ特異的ＩｇＧレベル。結果は、450 nm で測定された光学密度 (OD) として示されています。中心線、中央線。ボックス、25 ～ 75 パーセンタイル。ひげ、最小値から最大値まで。記号は個別の値を示します。nsCPD9+sCPD9 (0 日目) = 6、nmRNA+sCPD9 (0 日目) = 6、nmRNA+mRNA (0 日目) = 7、nAd2+Ad2 (0 日目) = 8、nmock+mock (0 日目) 0) = 5、nsCPD9+sCPD9 (2 日目) = 5、nmRNA+sCPD9 (2 日目) = 5、nmRNA+mRNA (2 日目) = 5、nAd2+Ad2 (2 日目) = 5、および nmock+mock (2 日目) 2) = 5 匹。 a-i については、Kruskal-Wallis と Dunn の多重比較検定が実行されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。

ソースデータ

sCPD9またはmRNAワクチンで追加免疫したハムスターは、プライムのみのワクチン接種を受けたハムスターよりもかなり多くの中和抗体を産生しました。全体的に、追加免疫ワクチン接種は、さまざまな変異体にわたって血清中和能力を増加させました（図3e-h）。テストされた変異体の中で、Omicron BA.1 は中和を回避する最大の能力を示しました。 sCPD9によるプライムブーストワクチン接種のみが、ハムスターにOmicron BA.1を中和する顕著な能力を与えた(図3h)。

プライムブースト sCDP9 および mRNA + sCDP9 ワクチン接種ハムスターは、スパイク、ORF3a、およびヌクレオカプシドタンパク質 (N) に対して顕著な IgG 抗体反応を示しましたが、プライムブースト mRNA および Ad2 ワクチン接種ハムスターからの IgG はスパイクタンパク質とのみ反応しました (図 3i)。 N および ORF3a に対する抗体はウイルスの中和に寄与する可能性は低いですが、これらの抗体が豊富に存在することは、LAV ワクチン接種によって誘発される広範な免疫学的応答を示しています。プライムブーストワクチン接種を受けた動物のより高いウイルス中和力価（図3a〜dとe〜hを比較）、およびこれらの動物の攻撃感染後のIgG抗スパイク反応性の増加（補足図4c）は、次の利点を示唆しています。追加ワクチン接種。

次に、プライムブーストワクチン接種に対する血液単細胞免疫応答を評価しました（拡張データ図3a）。血球計数により、sCPD9ワクチン接種およびAd2ワクチン接種を受けた初回追加免疫グループの細胞密度が有意に高いことが確認されました（図4a）。相対細胞数と絶対細胞数の両方から、ワクチン接種戦略間の実質的な違いが明らかになりました（図4bおよび拡張データ図3b〜d）。成熟好中球と未熟好中球（imPMN）の頻度は、特に重篤なCOVID-1927およびSARS-CoV-2に感染したシリアンハムスターで増加します26が、sCPD9 + sCPD9ワクチン接種動物で最も低かった（図4b）。対照的に、B細胞、T細胞、および形質細胞は逆の傾向に従い、sCPD9 + sCPD9レジーム後に最も高い存在量を示しました（図4bおよび拡張データ図3b）。肺での我々の観察と一致して、感染と炎症に関連する遺伝子は、ワクチン接種された動物の骨髄細胞で広く下方制御されていました（図4cおよび補足図5）。

a〜e、プライムブーストワクチン接種したハムスターの血液中の2 dpcでのscRNA-seqによる細胞組成と遺伝子発現の分析。 a、血液 1 ml あたりの細胞の手動カウント。 b、血球中の指定された細胞型の頻度。点線はナイーブハムスターで見つかった平均レベルを示しています（n = 3、ナイーブハムスターのデータは参考文献26から導出され、再処理されました）。棒グラフは平均±標準誤差、n = 3。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定を実施しました。 c、モック-モックワクチン接種動物と比較した、4つのプライム-ブーストワクチン接種戦略の示された細胞型における遺伝子発現の変化倍数を示すドットプロット。選択されたインターフェロン刺激遺伝子および炎症促進性サイトカインは、次のように視覚化されます。色とポイントサイズは、それぞれ、モックモックワクチン接種動物と比較したワクチン接種動物の log2 変換された FC 値と P 値を示します。 Padj は、両側 Wald 検定 P 値の Benjamini-Hochberg 補正を使用して DEseq2 によって計算されました。遺伝子は教師なしクラスタリングによって順序付けされます。 d、補足図9aに示す血液B細胞サブクラスターにおける選択されたB細胞発生マーカー遺伝子の発現を示すドットプロット。ドットのサイズは、それぞれの遺伝子の少なくとも 1 つの固有分子識別子 (UMI) が検出された細胞の割合を表し、色はそれらの細胞の平均発現に比例します。 e、B 細胞クラスター 3 で特定された前形質芽細胞 (pre-PB) の頻度と数、および B 細胞クラスター 6 で特定された記憶から前血漿芽細胞へ移行する細胞 (mem->pre-PB) の頻度と数。平均±の棒グラフ。 sem、n = 3。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定を実行しました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。

ソースデータ

ワクチン誘導性の免疫記憶の活性化を調査するために、我々はまず、プライムブーストワクチンを接種したハムスターのB細胞および形質細胞に焦点を当てて、循環B細胞の単一細胞トランスクリプトームを調べた。サブクラスター化により 8 つの集団が得られ (補足図 6a)、これらは既知のマーカー遺伝子 28,29 に基づいて細胞状態に割り当てられました。注目すべきことに、表面マーカー情報が存在しない場合、これらの割り当てはおそらく不完全なままになります。したがって、我々の分析では、遺伝子発現パターンの違いに焦点を当て、推定上の「記憶想起遺伝子発現サイン」が違いを示すかどうかを調査しました。まず、クラスター 8 が、たとえば Prdm1 (Blimp-1 をコードする) または Irf4 の存在により、おそらく形質芽細胞/形質細胞を表すと判断しました。クラスター 3 は、中間の Prdm1 レベル、および Tnfrsf17 および Tnfrsf13b を特徴としていました。比較したクラスター6は、Pax5、Cd19、Cd27、Bach2またはAicdaのレベルが高く、Prdm1、Xbp1またはSpibのレベルが低いことを示しました（補足図6b）。これらのパターンに基づいて、これら 2 つのクラスターには (事前) 形質芽細胞が含まれているため、記憶の想起を調査するのに最も興味深いと考えられました。 B 細胞制御に関与する一連の遺伝子を調べたところ、クラスター 3 では Irf4、Pax5、および Tnfrsf13b/c の上方制御が見つかりました。一方、クラスター 6 では、Bach2、Irf4、Pax5、および Tnfrsf13b/c が上方制御され、Aicda、Batf、および Cd27 が上方制御されていました。下方制御されています（図4dおよび補足図6c）。この潜在的な初期の「記憶想起遺伝子発現サイン」は、sCPD9による同種または異種プライムブーストワクチン接種時に最も強くなり、最も高い抗体力価を誘導しました（図3e-h）。これと一致して、クラスター3および6の細胞は、sCPD9 + sCPD9ワクチン接種されたハムスターにおいて有意に豊富であった（図4e）。

T 細胞の記憶想起の発生を調査するために、T 細胞とナチュラルキラー (NK) 細胞のサブクラスター化を進めました。この目的を達成するために、血液中のCD4+、CD8+、および増殖性T細胞をアッセイしました（図5a、b、および補足図7および8）。増殖（Mki67、Top2a）、ナイーブまたは中枢記憶状態（Sell、Ccr7、Lef1、Il7r）、およびT細胞の活性化（Cd69、Cd44、Klrg1、Icos、Cd40lg）を示す遺伝子発現の分析により、ほとんどの血中T細胞がナイーブまたは中枢記憶表現型のいずれか（クラスター0〜4、補足図7b〜e）。 2 dpc では、1 型免疫エフェクター遺伝子 (Tbx21、Gzma、Gzmb、Faslg、Ifn) は血液 NK 細胞によってのみ発現されました (クラスター 5、補足図 8)。増殖しているT細胞集団は、Il7rなどの記憶マーカーを発現する活性化T細胞で構成されていました（クラスター6、補足図8）。増殖している T 細胞は、一般に数が少ないにもかかわらず、異種ワクチン接種後に大幅に増加しました (図 5b)。これと一致して、sCPD9がワクチン接種計画に含まれている場合、細胞の割合と増殖関連遺伝子の発現レベルが最も高くなりました（図5c）。 T細胞抗原の特異性を決定するために、ハムスターにsCDP9またはmRNAのいずれかをワクチン接種し、14日後に組換えSARS-CoV-2 Sタンパク質またはNタンパク質で脾細胞を刺激しました。インターフェロンガンマ (IFN-γ) 酵素結合免疫吸着スポット (ELISpot) が読み出しとして機能しました。スパイクタンパク質刺激は両方のワクチンでIFN-γ分泌細胞を誘導しましたが、Nタンパク質で刺激すると、sCPD9ワクチンの脾細胞のみが模擬よりも有意に多くのIFN-γを分泌し、LAVワクチン接種時の優れたより広範なT細胞免疫を明らかにしました（図5d））。

a〜k、プライムブーストワクチン接種したハムスターのscRNA配列（2 dpc）によるT細胞サブセット。血液中の(a) CD4 (クラスター 0、1、2) および CD8 (クラスター 3、4) T 細胞、および (b) 増殖中の T 細胞 (クラスター 6) の頻度と数。平均値 ± 標準誤差の棒グラフ。nmock+mock = 4 を除くすべてのグループの n = 3。通常の一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。 c、血液クラスター6内の選択された遺伝子の発現を示すドットプロット（補足図7aのTおよびNKサブクラスター分析）。ドットサイズは UMI > 1 の細胞の割合を表し、色は発現を示します。 d、プライムワクチン接種後14日目のIFN-γ ELISpot分析。平均±標準誤差の棒グラフ、n = 6、各動物の中程度の刺激に正規化されたスポット数を個別に表示。点線、検出上限 (ULD)。二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。 e–g、(e) 組織常駐メモリー T 細胞 (Trm、クラスター 6)、(f) 活性化 T 細胞 (Act T、クラスター 2)、および (g) 増殖性 T 細胞 (prolif T 細胞、クラスター) の頻度と数。 5 + 8) 肺内。通常の一元配置分散分析と Tukey の多重比較検定。平均値±semの棒グラフ、nmock+mock = 4を除くすべてのグループのn = 3。a、b、d–gでは: *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、** **P < 0.0001。 h、肺、クラスター5および8における選択された遺伝子の発現を示すドットプロット（補足図9aのTおよびNKサブクラスター分析）。ドットサイズは UMI > 1 の細胞の割合を表し、色は発現を示します。 i、j、すべてのグループ（i）および個々のグループ（j）にわたる選択されたT細胞サブクラスターからの細胞におけるTrm遺伝子セット（参考文献28、31）のサインスコア。色はTrm遺伝子セットのサインスコアを示します。 k、クラスター 5 のセルの Trm サインスコア。中心、中央値。ボックス、25 ～ 75 パーセンタイル。とひげ、最小値から最大値まで。丸は、nmock+mock = 4 匹の動物を除くすべてのグループの n = 3 からプールされたクラスター 5 内の個々の分析された細胞を示します。ああ、パガ。ノードはクラスターを表し、エッジはクラスター接続の範囲を表し、ノードのサイズはクラスターのセル数に対応し、線の太さは接続性に比例します。 m、拡散擬似時間ランクの関数としての Trm シグネチャ (参考文献 28、31) スコア。黒い線は次数 3 の多項式適合を示します。

ソースデータ

次に、我々は、プライムブーストワクチン接種戦略の違いにより、肺の組織常駐メモリー T 細胞 (Trm) を再活性化する能力が異なるかどうかを調べました 30。肺 T 細胞サブセットを特徴付けるために、最初の T 細胞クラスターと NK 細胞クラスターを 10 個のサブクラスターにサブクラスター化しました (補足図 9a)。 Nkg7、Cd3e、Cd4、および Cd8a 遺伝子発現に基づいて、クラスター 3、7、および 9 を NK 細胞として、クラスター 4 を CD8+ T 細胞として、クラスター 0、1、2、および 6 を CD4+ T 細胞として、そしてクラスター 8 および増殖性T細胞（Mki67、Top2a）として5を示します（補足図9b、c）。 CD4 + T細胞クラスターのうち、クラスター2の細胞はエフェクター、活性化、および記憶遺伝子マーカーの混合表現型を示し(補足図9b〜eおよび10a、b)、クラスター0および1の細胞はナイーブまたは中央記憶タイプでした。（Sell、Ccr7、Lef1、Il7r、Tcf7、S1pr1）（補足図10a）。クラスター6では、ナイーブまたは中枢記憶関連シグネチャに関連する遺伝子は見つかりませんでしたが（補足図10a）、T細胞ホーミング遺伝子と組織保持遺伝子（Cxcr6、Rgs1、Prdm1、Znf683、Itga1およびItgae）、Trm ステータスを示す署名（補足図 10b、c、および 11）。 Trm細胞（クラスター6）は、sCPD9ワクチン接種グループにおいて、より高い遺伝子発現レベルと、顕著な組織ホーミング受容体であるCxcr6を発現する細胞分画を示しましたが、リンパ節滞留受容体S1pr1は最も検出されませんでした（補足図12a）。活性化されたT細胞（クラスター2）全体で、活性化遺伝子とエフェクター遺伝子の遺伝子発現は以前のワクチン接種とは無関係でした（補足図12a）。 2 dpc では、Trm 細胞、活性化および増殖中の T 細胞集団は小さく、全肺細胞の 2% 未満に相当しました。 Trm 細胞と活性化 T 細胞は、チャレンジされた sCPD9 ワクチン接種者においてより高い頻度と数を示す傾向がありましたが、増殖中の T 細胞のみが有意に高い値を示しました（図 5e-g）。注目すべきことに、血液中で増殖するT細胞とは対照的に、それらの肺対応物はより高いレベルのIfngおよびGzmaを発現した(図5h)。

次に、公開されているヒト Trm 遺伝子セット 31 のスーラクラスターをスコアリングし、高い Trm サインスコアを持つクラスター 5 の細胞のサブセット (増殖している T 細胞) を観察しました (図 5i)。 2 dpc では、増殖中の T 細胞 (クラスター 5) の Trm サインスコアは、sCPD9 ワクチン接種者で著しく高かった (図 5j、k)。クラスター 8 (増殖 T 細胞) では、全体の細胞数が少なすぎて解釈可能なスコアを生成できず、ワクチン接種を受けていない動物からは細胞が同定されませんでした (補足図 12b)。パーティションベースのグラフ抽象化（PAGA）アプローチ 32 を使用して、クラスター 2、8、5 の間、およびクラスター 2 と 6 の間の特に強い接続性、およびクラスター 6 と 8 の間の接続の可能性を特定しました（図 5l）。拡散擬似時間による全体的な発現類似性に従って細胞を順序付けし、このランクをTrmシグネチャーに対してプロットすると、クラスター2と6、およびクラスター8と5の間のパスがさらに裏付けられます。これには、可変のTrm様遺伝子発現が伴います（図5mおよび補足）。図12c、d)。全体として、これらの発見は、増殖性 T 細胞のサブセットが Trm リコール由来であり、sCPD9 ブーストハムスターにおける SARS-CoV-2 攻撃感染に応答して活性化されることを示唆しています。

強力な T 細胞記憶および体液性免疫に加えて、防御粘膜免疫の誘導は、ウイルス侵入部位に投与される LAV の特徴的な特性です 34。粘膜免疫の誘導とワクチンレジメンを相関させるために、SARS-CoV-2スパイク特異的IgAレベルと鼻洗浄液の中和能力を測定した。我々は、プライムのみのsCPD9ワクチン接種動物は、攻撃前後の鼻洗浄液中にかなり多量のIgAを保有していることを発見した（図6a）。攻撃感染により、sCPD9ワクチン接種動物におけるSARS-CoV-2スパイク特異的IgA抗体のレベルがさらに上昇し、mRNAおよびAd2ワクチン接種動物において検出可能な量が誘導された。プライムブーストした動物から得た鼻洗浄液を用いたSARS-CoV-2（変異体B.1）に対する微量中和アッセイにより、IgA測定値が確認された。 sCPD9ワクチン接種者は、2および5 dpcで著しく高い中和能力を示しました（図6b）。したがって、ワクチン接種された動物の鼻粘膜でIgA陽性リンパ球を同定しました（図6c）。組織病理学的スコアリングにより、sCPD9ワクチン接種動物では影響を受けた組織領域が少なく、損傷が少なく、免疫細胞の動員が減少していることが示されました（図6d、eおよび拡張データ図4a）。 sCDP9ワクチン接種は、2dpcでモックと比較して鼻洗浄液中のウイルスRNAを有意に減少させ(図6f)、これはウイルスNタンパク質の免疫組織化学染色におけるシグナルの減少と相関している(図6d)。粘膜免疫の推定上の有益な効果をさらに評価するために、鼻組織細胞の scRNA-seq に頼りました。まず、以前に公開されたマーカー遺伝子に基づいて細胞タイプに注釈を付けました (拡張データ図 4b35)。特に神経細胞では、差次的遺伝子発現分析により、インターフェロン刺激遺伝子（Isg15、Oasl2、またはRsad2）がsCPD9ワクチン接種者では発現が低いことが示されました（図6gおよび補足図13）。注目すべきことに、嗅上皮の神経細胞の傍観者反応は、SARS-CoV-2感染後の嗅覚喪失と関連している36。さらに、LAV ワクチン接種が SARS-CoV-2 の感染を防ぐという証拠も見つかりました。チャレンジ感染後、LAV ワクチン接種動物から放出されるウイルスの量は、mRNA ワクチン接種個体と比較して有意に低かった。この設定では、LAV ワクチン接種は SARS-CoV-2 の感染を防ぐことができましたが、mRNA ワクチン接種は防ぐことができませんでした (拡張データ図 5)。総合すると、sCPD9 LAV が下気道と上気道の両方で SARS-CoV-2 に対して優れた保護を提供するという証拠が得られ、臨床試験でのさらなる研究の有望な候補となっています。

a、チャレンジ後の指定の時点（dpc）におけるプライムワクチン接種ハムスターの鼻洗浄液中の抗スパイクIgAレベルを検出するELISA。結果はOD450を表示します。 b. 示された時点におけるプライム・ブーストワクチン接種ハムスターからの鼻洗浄液のB.1に対する中和能力。棒プロットは、時点ごとの平均±sd クラスカル・ウォリスおよびダンの多重比較検定を示します。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。記号は個々のハムスターを示します (グループあたり n = 5 匹)。 c、2 dpc における嗅上皮および粘膜下腺における IgA の免疫組織化学的染色。スケールバー、60 μm。 d、嗅上皮の縦方向の組織病理学的切片。2 dpc でのプライムのみの実験の H&E 染色 (左) および SARS-CoV-2 N タンパク質免疫組織化学 (右)、非感染組織の追加切片。 e、dと同様ですが、プライムブーストワクチン接種実験に関するものです。スケールバー、20 μm。 c〜eでは、画像は指定されたグループあたりn = 5匹のハムスターを表しています。プライム実験とプライムブースト実験は独立して実行されました。 f、初回ワクチン接種ハムスターの鼻洗浄液で2dpcおよび5dpcで検出されたウイルスRNA量。散布図では、線は平均を示し、記号は個々のハムスターを表します。 n = 5。二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。 *P < 0.05。 g、模擬ワクチン接種された動物と比較した、3つの主要ワクチン接種戦略の示された細胞型における遺伝子発現の変化倍数を示すドットプロット。選択されたインターフェロン刺激遺伝子と炎症促進性サイトカインは次のように視覚化されます。色とポイントサイズは、それぞれ、擬似ワクチン接種動物と比較したワクチン接種動物の log2 変換された FC 値と P 値を示します。 Padj は、両側 Wald 検定 P 値の Benjamini-Hochberg 補正を使用して DEseq2 によって計算されました。遺伝子は教師なしクラスタリングによって順序付けされます。

ソースデータ

現在の新型コロナウイルス感染症ワクチンは、重篤な疾患の予防に非常に効果的です。しかし、新たに出現した変異株による感染は予防されず、ワクチン接種を受けた人ではウイルス量が高くなる可能性があります37。ウイルスの伝播を制御し、症状のある感染を制限するには、ウイルス侵入部位の粘膜免疫が最も重要であると考えられています 38,39,40。

ここでは、LAV を含むクロスプラットフォームのワクチンの比較を紹介します。LAV は、特にウイルス侵入の粘膜部位で SARS-CoV-2 感染から優れた防御を引き出すことがわかりました。これは、LAV、タンパク質ベースまたはウイルスベクター化スパイクワクチン 24 の鼻腔内投与および粘膜免疫の効率的な誘導を使用した以前の前臨床 COVID-19 ワクチン研究と一致します 41,42,43,44。異種プライム-ブーストワクチン接種によって誘導される免疫力の向上に関する我々の観察は、全身初回刺激とそれに続くアデノウイルスベクターまたはmRNAワクチンによる鼻腔内追加免疫を組み合わせた最近の研究と一致しています19,45。重要なことは、ワクチン接種された動物の鼻粘膜におけるウイルス中和抗SARS-CoV-2 IgAが、sCPD9ワクチン接種された動物でははるかに高いことである。粘膜 IgA が、ウイルスの侵入の阻止、ウイルスとエンドソーム膜の細胞内融合の阻止、宿主細胞からのウイルスの放出の阻害など、さまざまな機能を発揮することはよく知られています 46。ウイルス複製、組織損傷、肺炎症からの全体的な防御は、sCPD9ワクチン接種動物で著しく良好でした。同時に、sCPD9 を投与された動物では抗原認識がかなり広範であり、これらの利点はおそらく LAV の重要な顕著な特徴の結果です。これらには、自然な感染経路を介した投与、ウイルスの完全な抗原レパートリーの提示、および標的病原体を模倣する複製が含まれます。さらに、LAV の活発な複製は、非複製ワクチンと比較してウイルス抗原の提示の延長と増加を引き起こす可能性があり、これがここで観察された有効性の向上に寄与する可能性があります。小規模実験では、LAV ワクチン接種は SARS-CoV-2 のその後の感染を阻止することができましたが、mRNA ワクチン接種は感染に対する影響がわずかでした。ワクチン接種済みおよびSARS-CoV-2攻撃感染したハムスターの血液、肺、鼻粘膜から採取したサンプルのscRNA-seq分析により、すべての重要なパラメーターにわたって、プライムのみの設定でのsCPD9ワクチン接種の効果が最も強かったことが明らかになった。同様に、プライム-ブースト設定では、二重 sCPD9 ワクチン接種が mRNA-sCPD9 ワクチン接種よりも優れており、次に二重 mRNA ワクチン接種、二重アデノウイルスワクチン接種が続きました。 sCPD9 ワクチン接種動物では、COVID-19 病因の主な特徴である炎症誘発性遺伝子発現プログラムの誘導が大幅に減少しました 47。これは、単球やマクロファージなどの自然免疫系の細胞に特に当てはまり、通常は SARS-CoV-2 の取り込み時に強力な炎症誘発性転写反応を示します 26。もしヒトに翻訳可能であれば、異種SARS-CoV-2変異株に感染した場合でも、軽度または無症候性の疾患経過をたどる可能性がはるかに高いことを意味する可能性がある。

さらに、適応免疫記憶の活性化に関連するいくつかの遺伝子発現サインも検出しました。 scRNA-seq による記憶 B 細胞由来の前形質芽細胞への発達の促進とチャレンジ動物の血液中での T 細胞増殖の促進は、記憶細胞の急速な活性化を示しています 48。また、sCPD9 を投与されたハムスターの肺では、増殖している T 細胞の数が大幅に増加していることも検出されました。これらの増殖中の T 細胞のサブセットは Trm 特異的な特徴を共有し、同定された Trm クラスターへの接続性を示しました。この観察について考えられる説明の1つは、sCPD9ワクチン接種後にSARS-CoV-2特異的な組織常在性メモリーT細胞の播種が強化され、これにより、対応するワクチン群でT細胞の増殖が強化されることを特徴とする、より迅速な局所想起反応が可能になる可能性があるということである。 LAV は自然感染を模倣し、IFN-γ49 を分泌する SARS-CoV-2 特異的 CD4+ Th1 細胞を誘導することが知られています。われわれは、増殖中の肺 T 細胞において IFN-γ の上方制御を検出した。これは、SARS-CoV-2 攻撃が Th1 エフェクター細胞型応答を誘発したことを示しており、IFN-γ ELISpot 分析により、LAV ワクチン接種ハムスターの脾細胞における多抗原反応性が明らかになった。粘膜 IgA 誘導は依然として感染と伝播を制限する上で最も重要ですが、気道記憶 CD4+ T 細胞は他のコロナウイルスに対する防御に貢献し 30、粘膜 SARS-CoV-2 ワクチンで認識される抗原レパートリーを強化する可能性があります。同様に、オボアルブミン抗原とさまざまなワクチン接種経路の組み合わせを使用した以前の研究では、粘膜送達によって IgA だけでなく一般的な Th1 媒介免疫も強化されることが示されました 50。

私たちの単一細胞 RNA シーケンス解析にはいくつかの制限があります。ここで使用されているこの技術は、表面マーカーや細胞タイプ固有の濃縮が欠如しているため、記憶細胞の再活性化などのプロセスを完全に捕捉することはできません。シリアンハムスターゲノムの注釈が不完全であるため、IgA 陽性細胞を特定できませんでした。鼻粘膜細胞のデータ品質は、組織の解離が難しいため比較的低く、初期感染部位での観察が制限されていました。攻撃ウイルス感染に対するワクチン接種の影響について私たちが提示したデータは予備的なものであり、検証には大規模な研究、より最近の SARS-CoV-2 変異体の使用、およびメカニズムの分析が必要です。私たちのデータは優位性を示しており、したがってLAVのさらなる開発と改良が期待されていますが、前臨床動物試験の結果をヒトの状況に推定することには注意が必要です。明らかに、弱毒化生ワクチンの安全性と有効性に関する臨床研究は、現在進行中のパンデミックと戦うこれらのワクチンの可能性を現実的に評価するために義務付けられています。

LAV の問題の 1 つは、以前に確立された免疫に対する潜在的な感受性です 51。これにより、ワクチンウイルスの複製が制限され、ワクチン接種または自然感染による初回免疫後の追加免疫としての使用が制限される可能性があります。我々はここで、sCPD9が最初のワクチン接種から3週間後に適用すると免疫応答を効果的に高め、防御を大幅に改善することを示す。重要なことに、sCPD9は、特にベータやオミクロンBA.1などの既知の免疫逃避変異体に対する体液性免疫応答を増強すると同時に、最初のワクチン接種の3週間後に追加免疫として適用すると、異種攻撃感染のウイルス学的転帰も改善します。これは、以前のワクチン接種または感染によって誘導された高度のベースライン免疫を示す集団におけるLAVの使用の範囲が広いことを示しています。

その高い安全性プロファイルにより、sCPD9 は最近、関連するドイツの州当局によってバイオセーフティレベル (BSL) 3 から BSL 2 に格下げされました 52。これは、臨床グレードのワクチンの生産を促進し、ヒトでの臨床試験を大幅に容易にするため、SARS-CoV-2 LAVの臨床応用に向けた重要な一歩となる。

インビトロおよび動物実験は、ドイツのベルリン自由大学ウイルス学研究所の BSL-3 施設で適切なバイオセーフティ条件下で実施されました。すべての動物実験は、動物の管理と人道的使用に関する関連する制度的、国内的および国際的なガイドラインに従って実施され、管轄州当局、Landesamt für Gesundheit und Soziales、Berlin、Germany (許可番号 0086/20) によって承認されました。

Vero E6 (ATCC から入手、CRL-1586)、Vero E6-TMPRSS2 (国立生物標準管理研究所 (NIBSC)、100978 から入手)、および Calu-3 (ATCC、HTB-55 から入手) 細胞を培養しました。 10% ウシ胎児血清、100 IU ml-1 ペニシリン G および 100 μg ml-1 ストレプトマイシンを含む最小必須培地 (MEM)、37 °C、5% CO2。さらに、Vero E6-TMPRSS2 細胞の細胞培養培地には、ネオマイシン耐性および TMPRSS2 の遺伝子を発現する細胞の選択を確実にするために、1,000 μg ml-1 のジェネティシン (G418) が含まれていました。

改変された弱毒化生 SARS-CoV-2 変異体 sCPD9 および SARS-CoV-2 変異体 B.1 (BetaCoV/ミュンヘン/ChVir984/2020; B.1、EPI_ISL_406862)、ベータ (B.1.351; hCoV-19/オランダ/) NoordHolland_20159/2021) および Delta (B.1.617.2; SARS-CoV-2、ヒト、2021、インドを除くドイツ、20A/452R (B.1.617)) を Vero E6-TMPRSS2 細胞上で増殖させました。 Omicron BA.1 (B.1.1.529.1; hCoV-19/ドイツ/BE-ChVir26335/2021、EPI_ISL_7019047) は、CaLu-3 細胞上で増殖しました。すべてのウイルスストックは感染実験の前に全ゲノム配列決定され、集団の大部分、特にフューリン切断部位における遺伝的完全性が確認されました。実験的感染の前に、ウイルスストックを-80 °Cで保存しました。

生後 9 ～ 11 週のシリアンハムスター (Mesocricetus auratus、品種 RjHan:AURA) を Janvier Labs から購入し、個別に換気されたケージで 2 ～ 3 匹のグループに分けて飼育しました。ハムスターには餌と水を自由に摂取させた。ワクチン接種の前に7日間、住環境に慣れさせた。どちらの実験でも、ケージの温度は 22 ～ 24 °C の一定範囲、相対湿度は 40 ～ 55% に維持されました。

感染実験では、シリアンハムスターをランダムにグループに割り当て、各グループの動物の 50 ～ 60% をメスにしました。最初の実験では、15 匹のハムスターに疑似ワクチン接種、または生弱毒化 sCPD9 ウイルス、Ad2 スパイク、または mRNA によるワクチン接種を行いました。 sCPD9 のワクチン接種は、麻酔下での鼻腔内点滴注入によって適用されました (1 × 105 焦点形成単位 (ffu)、60 μl)。 Ad2 スパイク (5 × 108 感染単位、200 μl) および mRNA ワクチン (5 μg mRNA、100 μl) を筋肉内に適用しました。模擬ワクチン接種したハムスターに、未感染のVero E6-TMPRSS2細胞から得た滅菌細胞培養上清を鼻腔内点滴注入することによってワクチン接種した。ワクチン接種の21日後、麻酔下での鼻腔内点滴注入によりハムスターにSARS-CoV-2 デルタ変異体（1×105プラーク形成単位（pfu）、60μl）を感染させた。 2 番目の実験では、10 匹のハムスターに模擬ワクチン接種、または 3 つのワクチン (上記参照) のいずれかをワクチン接種し、21 日後に追加ワクチン接種を行いました。追加免疫ワクチン接種の14日後、ハムスターを上記のように攻撃した。

ワクチン接種を受けた個体における攻撃ウイルスのその後の伝播を確認するために、グループあたり 3 匹の動物にプライムブーストレジメンでワクチン接種しました。この目的のために、ハムスターは、60μlのMEM中の1×104 ffu sCPD9delFCSを鼻腔内に、100μlの生理食塩水（滅菌水中0.9％NaCl）中の5μgのBNT162b2 mRNAを筋肉内に、または60μlのプレーンMEMを鼻腔内に（モック）投与されました。最初のワクチン接種から21日後に、それぞれのグループに対して同じワクチンを使用してワクチン接種を追加免疫した。

ワクチン接種したハムスターを、上記のように 1 × 105 pfu の SARS-CoV-2 変異体 B.1 で攻撃感染させました。感染の24時間後、感染したワクチン接種済みのハムスターを未処置の動物と接触させ、同居させて6日間連続で感染を監視した。ウイルスの排出と伝播を監視するために、各動物から毎日口腔スワブを採取しました。

前述のように、sCPD9 を Vero E6-TMRSS2 細胞上で増殖させ、Vero E6 細胞上で滴定しました。最終力価は、MEM で 2 × 106 ffu ml-1 に調整されました。組換え Ad2 スパイクは、前述のように生成され、293T 細胞上で生産され、精製されました 23。 BNT162b2 は市販品 (Comirnaty) として入手し、mRNA の最終濃度を 50 μg ml-1 (100 μg ml-1 はヒトでの使用の推奨濃度) に調整したことを除き、製造業者の推奨どおりに正確に取り扱いました。使用直前に注射用生理食塩水 (0.9% NaCl 滅菌水溶液) を添加します。

sCPD9 構築物の遺伝的安定性を高めるために、スパイクタンパク質のフリン切断部位 (FCS) を削除して sCPD9delFCS を作成しました。この FCS 欠失ワクチンウイルスは、この論文の感染研究にのみ使用されました (拡張データ図 5)。重要なのは、この研究で使用されたすべてのワクチンには、祖先B.1（武漢）配列に由来する同じSARS-CoV-2スパイク抗原が含まれていることです。

sCPD9 は、全身麻酔下 (0.15 mg kg-1 メデトミジン、2.0 mg kg-1 ミダゾラム、および 2.5 mg kg-1 ブトルファノール) を、動物あたり 1 × 105 ffu の用量で、総量 60 μl MEM 中で鼻腔内投与されました。送信実験 (拡張データ図 5) では、1 × 104 ffu sCPD9delFCS を同様に適用しました。 Ad2 スパイクを 200 μl の注入緩衝液 (3 mM KCl、1 mM MgCl2、10% グリセロールを含む PBS) 中で 5 × 108 感染単位で筋肉内注射しました。 BNT162b2を、100μlの生理食塩水（滅菌水中0.9％NaCl）中の動物あたり5μgのmRNAの用量で筋肉内注射した。

この研究では各ハムスターから鼻洗浄液を採取しました。この目的のために、鼻中隔が鼻の片側に無傷のまま残るように、各動物の頭蓋骨を傍正中でわずかに分割した。続いて、200μlのピペットチップを鼻中隔の下に注意深く滑らせ、150μlの洗浄液（30μg ml-1のオフロキサシンおよび10μg ml-1のボリコナゾールを含むPBS）を適用した。鼻孔から洗浄液を収集し、洗浄手順を 2 回繰り返しました。 3回目の洗浄後に約100μlのサンプルが回収されました。

プライムオンリーワクチン接種試験から得られた鼻洗浄液を、SARS-CoV-2 スパイク特異的 IgA 抗体の酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) 分析に供した。プライムブーストワクチン接種試験から得られた鼻洗浄液を微量中和アッセイに使用して、SARS-CoV-2 祖先変異体 B1 を中和する能力を評価しました。

複製能力のあるウイルスの定量化には、50 mg の肺組織を使用しました。臓器サンプルをビーズミル（Analytic Jena）で均質化した後、10倍段階希釈物を調製した。希釈液を 24 ウェルプレートで増殖させた Vero E6 細胞上にプレーティングし、37 °C で 2.5 時間インキュベートしました。続いて、細胞を1.5%カルボキシメチルセルロースナトリウム(Sigma Aldrich)を含むMEMで覆い、感染の72時間後に4%ホルムアルデヒド溶液で固定した。プラーク形成単位を計数するために、プレートを0.75%メチレンブルーで染色した。

肺は前述のように処理されました53。左肺葉を注意深く除去した後、組織をPBS緩衝4%ホルムアルデヒド溶液(pH7.0)中で48時間固定した。甲介の準備のために、左頭蓋骨半分の一部をそれに応じて固定しました。その後、肺または耳甲介を鼻腔から静かに取り出し、パラフィンに包埋し、2 μm の厚さに切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色しました。肺での in situ ハイブリダイゼーションは、製造元の指示に従い、若干の調整を加えて、ViewRNA ISH 組織アッセイキット (Invitrogen by Thermo Fisher) を使用して、前述のように 54 実施しました。 SARS-CoV-2 RNA の局在化には、N 遺伝子配列 (NCBI データベース NC_045512.2、ヌクレオチド 28,274 ～ 29,533、アッセイ ID: VPNKRHM) を検出するプローブを使用しました。配列特異的結合は、ニューモリシン検出用のプローブを使用することによって制御されました。甲介の免疫組織化学は、以前に記載されているように実施されました 55 (詳細は補足方法)。

盲検顕微鏡分析は、認定獣医病理学者 (JB) によって実行されました。

ワクチン接種後の血清中の SARS 特異的 IgG レベルと鼻洗浄液中の SARS 特異的 IgA レベルを調査するために、社内 ELISA が実行されました (詳細は補足方法)。

プライムブーストワクチン接種試験で得られた鼻洗浄液の本物の SARS-CoV-2 (B.1) を中和する能力を評価するために、鼻洗浄液を 50 μg ml-1 エンロフロキサシンと 10 μg を含む 2× MEM で 1:1 に希釈しました。 ml−1 ボリコナゾール。その後の段階希釈は、25 mg ml-1 エンロフロキサシン、5 μg ml-1 ボリコナゾールおよび 1% FBS を含む MEM で実行されました。 SARS-CoV-2 (50 pfu) を鼻洗浄液の希釈液に加え、1:2 ～ 1:256 の希釈液を、96 ウェル細胞培養プレートに播種したほぼコンフルエントな Vero E6 細胞に播種しました。接種の３日後、細胞を固定し、メチレンブルーで染色した。ウイルス中和希釈液を同定するために、鼻洗浄液またはウイルスを含まない対照ウェルとの比較によって細胞単層の完全性を評価しました。ウイルス誘発性の細胞変性効果の証拠がない最後の希釈を、それぞれのサンプルの中和力価とみなしました。

血清サンプルは、さまざまな SARS-CoV-2 変異体を中和する能力についてテストされました。プライムブースト試験の 0 日目のサンプルは、材料が不足しているため、B.1.351 (ベータ) に対する中和抗体についてテストできませんでした。血清は 56 °C で 30 分間不活化されました。 2 倍段階希釈 (1:8 ～ 1:1,024) を 96 ウェルプレートにプレーティングし、200 pfu の SARS-CoV-2 を各ウェルにピペットで加えました。 37℃で1時間のインキュベーション時間の後、希釈液をサブコンフルエントなVero E6細胞を含む96ウェルプレートに移し、37℃で72時間（B.1、ベータ、デルタ）または96時間インキュベートしました。 37℃（オミクロン）。プレートを４％ホルムアルデヒド溶液で固定し、０．７５％メチレンブルーで染色した。細胞変性効果を示さなかったウェルは中和されたとみなした。

ハムスター IFN-γ ELISpot 分析は、以前に記載されているように実行されました 56。簡単に言うと、ハムスター IFN-γ ELISpotBASIC キット (MABTECH) を使用して、それぞれ異なる刺激と共培養した 5 × 105 個の単離脾細胞による IFN-γ 分泌を検出しました。培地で処理した脾細胞は陰性対照として機能し、組換え卵白アルブミン (10 mg ml-1) を陰性タンパク質対照刺激として使用しました。Ｔ細胞の一般的な刺激は、５μｇｍｌ−１のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を使用して達成された。組換え SARS-CoV-2 (2019-nCoV) スパイクタンパク質 (S1 + S2 ECD、His タグ、10 mg ml-1、Sino Biological Europe) または 10 mg ml-1 組換え SARS-CoV-2 (2019-nCoV) ヌクレオカプシドタンパク質 (N) (Sino Biological Europe) を使用して、SARS-CoV-2 特異的 T 細胞を再刺激しました。 Eli.Scan ELISpot スキャナー (AE.L.VIS) および分析ソフトウェア ELI.Analyse v5.0 (AE.L.VIS) を使用してスポットをカウントしました。

口腔咽頭スワブおよび２５ｍｇの均質化肺組織中のゲノムコピーを定量化するために、ｉｎｎｕＰＲＥＰウイルスＤＮＡ／ＲＮＡキット（ＡｎａｌｙｔｉｃＪｅｎａ）を製造業者の指示に従って使用してＲＮＡを抽出した。 qPCR は、NEB Luna Universal Probe One-Step RT–qPCR キット (New England Biolabs) を使用し、逆転写には 55 °C で 10 分間、酵素の活性化には 94 °C で 3 分間、40 サイクルのサイクル条件で実行しました。密閉した qPCR 96 ウェルプレート内の qTower G3 サイクラー (Analytic Jena) で、94 °C で 15 秒、58 °C で 30 秒の反応。プライマーとプローブは以前に報告されたように使用されました57。オリゴヌクレオチド (配列 (5'-3')): E_Sarbeco_F: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT;

E_Sarbeco_R: ATATTGCAGCAGTACGCACACA;

E_Sarbeco_P1: FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ。

遺伝子発現の定量化には、NCBI ゲノムデータベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/11998?genome_assembly_id=1585474) 経由で利用可能な MesAur 2.0 ゲノムアセンブリとアノテーションを使用しました。 GFF ファイルは、gffread 0.12.758 を使用して GTF に変換されました。重複が生成されなかった場合、アノテーション内の 3'-UTR は前述のように 1,000 bp 延長されました 59。 GTF ファイルのさらなる洗練手順については、この論文に添付されている GitHub ページ (https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and) で説明されています。 -SARS-CoV-2 に対する全身免疫）。分析に使用された最終的な gtf ファイルは、GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596) から入手できます。

RNAバルク配列決定を行うために、製造業者(Ambion、Life Technologies)の指示に従ってTrizol試薬を使用して肺組織からRNAを単離した。簡単に説明すると、1 ml のトリゾールを均質化した臓器サンプルに加え、十分にボルテックスしました。 20分間のインキュベーション時間後、200μlのクロロホルムを添加した。サンプルを再度ボルテックスし、室温で 10 分間インキュベートしました。続いて、チューブを 12,000 × g、4 °C で 15 分間遠心分離し、500 μl の水相を 10 μg の GlycoBlue を含む新しいチューブに移しました。イソプロパノール (500 μl) を添加し、続いて上記のようにサンプルをボルテックスし、インキュベートし、遠心分離しました。その後、イソプロパノールを除去し、１ｍｌのエタノール（７５％）を適用した。チューブをすぐに逆さにし、8,000 × g で 10 分間遠心分離しました。ペレットからエタノールを除去した後、RNA を 30 μl の RNase フリー水に再懸濁し、-80 °C で保存しました。

白血球は、前述のように EDTA 血液から単離されました。手順には、計数前の赤血球溶解と細胞濾過が含まれます。肺細胞（尾葉）は以前に記載されているように単離されました26,60。ステップには、トリパンブルーで計数する前の酵素消化、機械的解離および濾過が含まれます。バッファーには、手順中の新規転写を防ぐために 2 μg ml-1 のアクチノマイシン D が含まれていました。

SARS-CoV-2に感染したハムスターの鼻粘膜から単細胞懸濁液を得るために、鼻中隔が鼻の左側に無傷のまま残るように、各動物の頭蓋骨を傍正中でわずかに分割した。鼻の右側を頭蓋から慎重に取り出し、さらに使用するまで、1% BSAおよび2 μg ml-1 アクチノマイシン Dを含む氷冷1×PBS中に保存した。鼻の部分を、750 U ml-1 コラゲナーゼ CLS II および 1 mg ml-1 DNase を補充した 5 ml コーニングディスパーゼ溶液に移し、37 °C で 15 分間インキュベートしました。鼻粘膜からの細胞の調製のために、鼻甲介を鼻腔から注意深く取り出し、消化培地中で37℃で20分間再インキュベートした。ピペットで採取し、プランジャーで 70 µm のフィルターを押し通すことによって、甲介組織を解離させました。 1% BSA および 2 μg ml-1 アクチノマイシン D を含む氷冷 PBS を添加して、酵素消化を停止しました。細胞懸濁液を 400 × g、4 °C で 15 分間遠心分離し、上清を廃棄しました。ペレット化した鼻細胞を5 mlの赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、室温で2分間インキュベートした。溶解反応を0.04% BSAを含む1×PBSで停止し、細胞を400×g、4℃で10分間遠心分離しました。ペレット化した細胞を、0.04% BSAを含む1×PBSに再懸濁し、40μm濾過した。生細胞をトリパンブルーで計数し、計数室を使用して生存率を測定しました。 scRNA-seq の細胞濃度は希釈によって調整しました。

シリアンハムスターの血液、肺、鼻腔から単離した細胞を、細胞多重化のためのフィーチャーバーコーディング技術を備えた 10× Genomics Chromium Single Cell 3' Gene Expression システムを使用して scRNA-seq に供しました（詳細は補足方法）。

シーケンシングリードは、最初に bcl2fastq 2.20.0 および Cell Ranger 6.0.2 ソフトウェアの multi コマンドを使用して処理されました。セルプレックス逆多重化については、割り当てのしきい値が部分的に調整されました (詳細については、https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-の GitHub ページを参照してください)。 SARS-CoV-2 に対する粘膜免疫および全身免疫）。さらなる処理は、R 4.0.4 Seurat R 4.0.6 package61、R パッケージ ggplot2 3.3.5、dplyr 1.0.7、DESeq2 1.30.1、lme4 1.1–27.1 および依存関係、および Python 3.9.13 で行われました。 Python パッケージ scanpy 1.9.1、scvelo 0.2.4、および依存関係も含まれます。次のステップでは、緩やかな品質しきい値 (細胞あたり最低 250 個の検出遺伝子) で細胞をフィルターし、クラスター化しました。次に、細胞タイプにクラスターごとに注釈が付けられ、細胞タイプ固有のしきい値を使用してフィルター処理されました (中央値を下回る細胞または細胞タイプ内の最下位四分位にある細胞は除去されました)。残りのセルは SCT/統合ワークフロー 62 を使用して処理され、結果として得られた Seurat オブジェクトにセルタイプに再度注釈が付けられました。下流分析用のすべてのコードは、GitHub (https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to-) で入手できます。 SARS-CoV-2。

前処理ステップを含むシーケンスデータの統計解析の詳細については、個々の「方法」セクションで説明されています。ウイルス学的、組織病理学的、ELISA、細胞頻度および細胞数統計の分析は、GraphPad Prism 9 を使用して実行されました。統計の詳細は、それぞれの図の凡例に示されています。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。データ分布は正常であると想定されていましたが、これは正式にテストされていませんでした。分析から除外されたデータはありません。生きた動物を含むすべての実験はランダム化されましたが、他の実験はランダム化されませんでした。研究者らは、動物実験および主要結果評価（臨床開発、ウイルス滴定、qPCR、ELISpot、血清学および組織病理学）中のハムスターの割り当てについて知らされていなかった。研究者らは、他の実験や分析での配分について知らされていなかった。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

生の配列決定データは、GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE200596) で入手可能であり、バルク RNA-seq リードカウントテーブル、h5 マトリックス、スーラも入手できます。 scRNA-seq データのオブジェクト。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

コードは GitHub (https://github.com/Berlin-Hamster-Single-Cell-Consortium/Live-attenuated-vaccine-strategy-confers-superior-mucosal-and-systemic-immunity-to-SARS-CoV-) で入手できます。 2.

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リファレンスをダウンロードする

研究計画の支援と、結果と結論に関する多大な議論を行ってくれたCharitéのVM Cormanに感謝します。抗 SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド抗体の提供に対して S. Reiche (Friedrich-Loeffler-Institut、グライフスヴァルト、ドイツ)。 C. Thöne-Reineke 氏、動物福祉と畜産業への支援を感謝。この研究で使用された SARS-CoV-2 変異株の提供には、ヨーロッパウイルスアーカイブの D. Bourquain (ロバートコッホ研究所、ドイツ、ベルリン) と C. Reusken (国立公衆衛生環境研究所、ビルトーフェン、オランダ) が協力していただきました。。 Vero E6-TMPRSS2 細胞は、M. Takeshita の協力により、英国の NIBSC Research Reagent Repository から提供されました。資金は、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム - EVA-GLOBAL 助成金 871029 によって提供されました。ドイツ連邦政府助成金 OS 143/16-1 (NO); ドイツ連邦政府助成金 SFB TR84、サブプロジェクト Z01b (JT、ADG); ドイツ連邦政府助成金 SFB TR84、サブプロジェクト C06 および C09 (MW)。ドイツ連邦政府助成金 SFB 1449–431232613、サブプロジェクト B02 (MW、GN)。 Bundesministerium für Bildung und Forschung - MAPVAP 助成金 16GW0247 (GN、MW); Bildung und Forschung 連邦大臣 - Organo-Strat 助成金 01KX2021 (ADG); Bundesministerium für Bildung und Forschung - e:Med CAPSyS 助成金 01ZX1604B (MW); Bundesministerium für Bildung und Forschung - e:Med SYMPATH 助成金 01ZX1906A (MW); ゲズントハイト連邦大臣 – CHARIS 6a 補助金 (MDM); アインシュタイン財団 3R 助成金 EZ-2020-597 FU (ADG); ヘルムホルツ協会のイニシアチブおよびネットワーキング基金 - COVIPA 助成金 KA1-Co-02 (GTA、ML、EW)。シャリテ 3R 補助金 (PP、CG)。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定や原稿の準備には何の役割もありませんでした。

ベルリン自由大学が提供するオープンアクセス資金。

これらの著者は同様に貢献しました: Geraldine Nouailles、Julia M. Adler。

この作品は、Emanuel Wyler、Dusan Kunec、Jakob Trimpert の著者が共同で監修しました。

ベルリン・シャリテ大学感染症・呼吸器内科・救命救急学科、ベルリン自由大学およびベルリン・フンボルト大学の法人会員（ドイツ、ベルリン）

ジェラルディン・ヌアイユ、ジュリア・M・アドラー、ピーター・ペニッツ、モリス・バウムガルト、ジェンギズ・ゴケリ、マーティン・ヴィッツェンラート

ベルリン自由大学ウイルス研究所、ベルリン、ドイツ

ジュリア・M・アドラー、クリスティーン・ラングナー、リカルド・マルティン・ビダル、ナ・シン、アザ・アブデルガワド、ニコラウス・オステリエダー、ドゥサン・クネック、ヤコブ・トリンパート

ベルリン大学病理学研究所 - ベルリン大学およびベルリン・フンボルト大学の法人会員、ベルリン・フンボルト大学 IRI ライフサイエンス生物学研究所、ベルリン、ドイツ

ステファン・ペイドリ & ニルス・ブリュートゲン

ベルリン医療システム生物学研究所 (BIMSB)、ヘルムホルツ協会 (MDC) マックスデルブリュック分子医学センター、ベルリン、ドイツ

ルイス・グスタボ・テイシェイラ・アウベス & エマヌエル・ワイラー

ベルリン自由大学動物病理学研究所、ベルリン、ドイツ

ジュディス・ブッシュ、アン・ヴォス、アリーナ・ランゲンハーゲン、アヒム・D・グルーバー

ベルリン大学ウイルス学研究所、シャリテ大学、ベルリン自由大学およびベルリン・フンボルト大学の法人会員、ベルリン、ドイツ

ファビアン・ポット、ジュリア・カズミエルスキー、ダニエラ・ニーマイヤー、クリスチャン・ドロステン、クリスティーヌ・ゴフィネ

ベルリン保健研究所 (BIH)、ベルリン、ドイツ

ファビアン・ポット、ジュリア・カズミエルスキ、クリスティーヌ・ゴフィネ

IVMP の製品試験、獣医学部門、パウル・エールリッヒ研究所、ランゲン、ドイツ

アイリーン・エベニグ、モナ・V・ランゲ、マイケル・D・ミュールバッハ

ドイツ感染症研究センター (DZIF)、パートナーサイト、ギーセン・マールブルク・ランゲン、ドイツ、ギーセン

マイケル・D・ミュールバッハ

キプロス国際大学医学部（キプロス、ニコシア）

ジンギス・ゴケリ

ベルリン大学生理学研究所、ベルリン自由大学およびベルリン・フンボルト大学の法人会員、ベルリン、ドイツ

シャンドール・シモンズ

ベルリン大学産婦人科、ベルリン自由大学およびベルリン・フンボルト大学の法人会員、ベルリン、ドイツ

スザンヌ・ハーウィグ & ギュンター・シション

ドイツ感染症研究センター (DZIF)、パートナーサイトシャリテ、ベルリン、ドイツ

ダニエラ・ニーマイヤー & クリスチャン・ドロステン

ベルリン医療システム生物学研究所 (BIMSB) ヘルムホルツ協会 (MDC) のマックスデルブリュック分子医学センター、およびベルリンフンボルト大学生物学研究所 (ドイツ、ベルリン)

マルクス・ランドターラー

重慶大学生命科学部、重慶、中国

ウー・ハイボ

ベルリン大学シャリテ健康研究所、ベルリン、ドイツ

サマンサ・D・プラクティクニョ

中国、香港、九龍、香港城市大学ジョッキークラブ獣医生命科学学院感染症公衆衛生学部

ニコラス・オステリエダー

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DK と JT はプロジェクトの概念を策定しました。 GN、JMA、PP、SP、GTA、MB、JB、AV、AL、FP、JK、C. Goekeri、DN、HW、SDP、EW、DK、JT が方法論を開発しました。 GN、JMA、PP、SP、GTA、JB、AV、AL、AE、MVL、MDM、SS、NX、CL、RMV、AA、SH、HW、ADG、SDP、EW、DK、JT が調査を実施しました。 GN、JMA、PP、SP、GTA、JB、AV、AL、SDP、EW、DK、JT が可視化を実施しました。 GN、GC、ADG、C. Goffinet、MW、DN、CD、および JT がリソースを取得しました。 NOとJTが出資を獲得。 JTがプロジェクトを主導した。 GN、GC、CD、C. Goffinet、ML、NB、MW、ADG、SDP、NO、DK、EW、JT がプロジェクトを監督しました。 GN、JMA、EW、DK、JT が原案を作成しました。著者全員が原稿をレビューし、編集しました。

ジェイコブ・トリンパートへの通信。

この研究に関連して、ベルリン自由大学は、ヒトにおけるワクチンとしての sCPD9 の使用に関する特許出願 (FU227EP - 22193939.0-1111、ベルリン自由大学、ドイツ) を提出しました。この出願では、JT、NO、DK が sCPD9 の発明者として指名されています。ベルリン自由大学は、sCPD9 のさらなる開発のために RocketVax Inc. と協力しており、研究への資金提供を受けています。この研究とは別に、GN は Biotest AG からプロジェクト資金を受けています。 MW と MW は、Bayer Health Care、Biotest、Pantherna、Vaxxilon から研究に対する資金提供を受け、また Alexion、Aptarion、Astra Zeneca、Bayer Health Care、Berlin Chemie、Biotest、Boehringer Ingelheim、Chiesi、Glaxo Smith Kline、Insmed、ノバルティス、テバ、ヴァキシロン。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Duane Wesemann と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) 初回ワクチン接種を受けたハムスターの体重発達をパーセントで、ウイルス攻撃時点までの 21 日間測定し、ワクチン接種グループに従って表示しました。四分位数と中央値を含むバイオリンプロット (切り捨て)。 (b) プライムブースト実験: 均質化された肺組織からのバルク RNA シーケンス分析後に生成された、全ゲノム転写物と比較した、SARS-CoV-2 正準ジャンクションにまたがるウイルス mRNA 転写物の総発現の相対発現。値は、分析された両方の時点について log10 スケールで表示されます。平均値を含む散布ドットプロット。二元配置 ANOVA (分散分析) および Tukey の多重比較検定。 (c – j) プライム (c – f) およびプライムブースト設定 (g – j) に含まれるシリアンハムスターの組織病理学的所見の半定量的スコア: (c、g) 左肺葉で見つかった統合肺領域が表示されます。割合で。 (d、h) 気管支炎スコアは、気管支上皮壊死および気管支炎の重症度を説明します。 (e、i) 局所細胞性免疫応答を考慮するために、好中球、リンパ球、およびマクロファージの肺浸潤を白血球流入スコアで評価しました。 (f、j) 左肺葉の内皮炎の程度は内皮炎スコアで示されます。 (c – j) 結果は、中心 (中央値)、ボックス (25 ～ 75 パーセンタイル)、およびひげ (最小～最大) プロットとして表示されます。二元配置分散分析と Tukey の多重比較検定。 ∗p < 0.05、∗∗p < 0.01、∗∗∗p < 0.001、および ∗∗∗∗p < 0.0001。 (b – j) すべてのグループの n = 5 匹の個別のハムスター。プライム実験とプライムブースト実験は独立して実施されました。

ソースデータ

5 dpc でのプライムのみおよびプライムブーストワクチン接種実験からのヘマトキシリンおよびエオシンで染色された肺切片の代表的な組織病理学。画像は、示されたグループあたり n = 5 匹のハムスターを表しています。プライム実験とプライムブースト実験は独立して実行されました。どちらの実験でも、列は左から右に、気管支炎、呼吸肺胞に影響を与える肺炎、および内皮炎を伴う血管を示しています。プライムのみのアプローチでは、壊死性上皮性および過形成性気管支炎を発症した他のすべてのグループとは対照的に、リンパ球および形質細胞によるBALT様の上皮下浸潤の存在下で、sCPD9ワクチン接種ハムスターのみが無視できる程度の気管支炎を起こしました。肺では、sCPD9 ワクチン接種動物の肺胞は、呼吸実質の硬化がはるかに少なく、浸潤マクロファージおよび好中球も少なかった。 Ad2 および模擬ワクチン接種した動物のみが顕著な肺胞化生リモデリングを発症し、これは肺胞上皮の壊死後の再生を示しています。内皮炎は、模擬ワクチン接種を受けた動物と比較して、すべてのワクチン接種群で軽度でした。プライム-ブースト実験では、過形成気管支炎は、sCPD9+sCPD9およびmRNA+sCPD9ワクチン接種ハムスターで最も軽度でした。呼吸実質の硬化および肺胞炎は、両方の sCPD9 ブースター群で最も軽度でした。化生上皮リモデリングは、Ad2-Ad2 ワクチン接種動物で特に顕著でした。内皮炎は、すべての追加免疫グループで同様の程度まで大幅に減少しました。スケールバー = 各列の 20 μm。

ソースデータ

(a) プライムブースト実験からの血球の UMAP を使用した単一細胞トランスクリプトームの 2 次元投影。細胞は、既知のマーカー遺伝子に基づいて注釈が付けられた細胞タイプごとに色付けされます。 (b、d) プライムブースト実験における血液 1 ml あたりの細胞成分の数。 (c) プライムブースト実験の血球成分のパーセンテージ。 (b – d) 細胞タイプごとのモック-モックグループに対する一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定が示されています。平均値 ± SEM、記号は個々のハムスターを表します。 nsCPD9 + sCPD9 = 3、nmRNA + sCPD9 = 3、nmRNA + mRNA = 3、nAd2 + Ad2 = 3、nmock + mock = 4 匹のハムスターをシンボルとして示します。 ∗p < 0.05、∗∗p < 0.01、および ∗∗∗p < 0.001。

ソースデータ

（a）プライムワクチン接種（上の行）またはプライムブーストワクチン接種（下の行）を受けたハムスターにおける組織病理学的所見の半定量的スコア。 SARS-CoV-2感染による粘膜損傷の影響を受けた面積をパーセンテージで示します。組織損傷スコアは、上皮剥離、壊死、アポトーシス、細胞破片および繊毛の損失を考慮します。鼻甲介内の好中球とリンパ球の存在は、免疫細胞スコアによって評価されます。中心（中央値）、ボックス（25 ～ 75 パーセンタイル）、およびひげ（最小～最大）。統計的評価のために、二元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定を実行しました。 N = グループあたり 5 匹のハムスター。 ∗p < 0.05、∗∗p < 0.01、∗∗∗p < 0.001、∗∗∗∗p < 0.0001。 (b) プライム実験からの鼻組織細胞の UMAP を使用した単一細胞トランスクリプトームの 2 次元投影。色分けは、既知のマーカー遺伝子に基づいて注釈が付けられた細胞タイプを示します。

ソースデータ

(a) 原理実証以降の伝送実験の設計。ハムスターに、プライム-ブーストスケジュールで、フリン切断部位欠失sCPD9 LAVまたはBNT162b2 mRNAワクチンをワクチン接種した。 SARS-CoV-2変異体B.1を用いて攻撃感染を実施し、ワクチン接種および攻撃を受けた動物を、攻撃の24時間後から連続6日間、未処置の接触動物と同居させた。 (b) 共同飼育期間中、ワクチン接種を受けた小屋から採取した毎日の口腔スワブ中の SARS-CoV-2 RNA 量。 N = 1 グループあたり 3、平均値 ± SEM。二元配置分散分析、Tukey の多重比較検定。 (c) 肺における SARS-CoV-2 RNA 量、および (d) ワクチン接種された脱皮動物の終了時の咽頭スワブ。 N = 3、平均±SEM、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。（ e ）共同飼育期間中、未感染の接触動物から採取した毎日の口腔スワブ中のSARS-CoV-2 RNA量。 N = 3、平均±SEM。二元配置分散分析、Tukey の多重比較検定。 (f) 肺における SARS-CoV-2 RNA 量、および (G) 接触経験のない動物の終了時の咽頭スワブ。 N = 3、平均±SEM、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。 ∗p < 0.05、∗∗p < 0.01、∗∗∗p < 0.001、∗∗∗∗p < 0.0001。パネル a は BioRender.com で作成されました。

ソースデータ

補足図。 1 ～ 13、方法と参考文献。

補足数字の統計ソースデータ。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Nouailles、G.、Adler、JM、Pennitz、他。弱毒化生ワクチン sCPD9 は、ハムスターの SARS-CoV-2 変異株に対する優れた粘膜免疫および全身免疫を誘発します。 Nat Microbiol 8、860–874 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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受信日: 2022 年 6 月 30 日

受理日: 2023 年 3 月 1 日

公開日: 2023 年 4 月 3 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01352-8

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